Protéomique

Dossier réalisé avec la collaboration de Jérôme Garin, directeur de recherche au sein de la Direction des sciences du vivant du CEA, directeur de l’Institut de recherche en technologies et sciences pour le vivant (IRTSV), directeur de l’unité U1038 (Inserm/CEA/UJF) et coordonnateur de l’infrastructure nationale de protéomique (ProFI - Mars 2013.
La protéomique, c’est l’histoire de la chenille et du papillon. Ces deux organismes apparemment si différents ont exactement le même génome. Ce qui les distingue, ce sont les produits finaux d’expression de leurs gènes, c’est à dire leurs protéines. Cet exemple montre à quel point il est nécessaire, pour comprendre un organisme, de s’intéresser à ses protéines et pas seulement à son génome.

La protéomique consiste à étudier l’ensemble des protéines d’un organisme, d’un fluide biologique, d’un organe, d’une cellule ou même d’un compartiment cellulaire. Cet ensemble de protéines est nommé « protéome ».

Le protéome est une entité dynamique et complexe. Au sein de chaque cellule, le contenu de protéines se modifie en permanence en fonction des conditions intra ou extra cellulaires. De plus, par le biais de réarrangements qui modifient ses fonctions biologiques, un même gène peut donner naissance à plusieurs protéines. Le protéome contient donc un nombre beaucoup plus important de protéines que le génome ne contient de gènes.

L’étude du protéome révolutionne la connaissance du vivant
Les principaux objectifs de la protéomique sont d’identifier et de quantifier les protéines présentes dans un échantillon biologique à un instant T, et d’obtenir des données fonctionnelles : localisation, identification de protéines partenaires, sites de liaison de ligands... Ces données permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliquées dans les grandes fonctions cellulaires. Il est par exemple possible d’étudier des voies de signalisation impliquées dans des processus biologiques ou dans l’apparition de maladies. En comparant les échantillons de personnes en bonne santé et de personnes malades (inclues dans de grandes cohortes), la protéomique permet également de découvrir et valider l’utilisation de biomarqueurs protéiques utiles au dépistage de maladies, au suivi de leur évolution ou encore à l’évaluation de l’efficacité d’un traitement. .
Human Protein Project (HPP)
Un vaste projet international de protéomique, sur le modèle de celui qui existe en génomique, a été lancé en 2011. Piloté par l’Human Proteome Organisation (HUPO), une organisation internationale, il consiste à créer une base de données unique permettant de décrire les protéines correspondant aux 20 300 gènes codants chez l’homme. Les différents pays partenaires de ce projet se sont répartis les chromosomes qu’ils annotent progressivement. La France est en charge du chromosome 14. D’autres volets de ce projet consistent à caractériser les protéomes du plasma, du foie, du cerveau, du système immunitaire, du rein, de l’urine ou encore du système cardiovasculaire. L’hétérogénéité des protéomes d’un individu à l’autre et leur caractère dynamique rendent cet exercice difficile, mais il présente l’avantage de promouvoir la protéomique et de stimuler les coopérations internationales.

La spectrométrie de masse au service de l’étude des protéines

Analyse sur un écran des résultats d'un spectromètre de masse (MALDI/TOF) des cellules tumorales humaines. Unité de recherche Inserm 896. Institut de recherche en cancérologie de Montpellier (IRCM)
L’étude des protéines a connu un essor spectaculaire au cours des années 90, avec l’avènement d’appareils - les spectromètres de masse - compatibles avec l’analyse de ces grosses molécules (ce qui valu le prix Nobel de chimie en 2002 à John Fenn et Koichi Tanaka). Jusque-là, les scientifiques utilisaient une méthode chimique qui nécessitait de purifier des quantités importantes de chaque protéine avant de pouvoir en déterminer la séquence en acides aminés. Aujourd’hui, les spectromètres de masse permettent d’analyser des échantillons biologiques complexes, pouvant contenir des milliers de protéines, dont certaines présentes en faible quantité.

La spectrométrie de masse consiste à identifier des molécules en fonction de la mesure précise de leur masse. Pour réaliser une étude protéomique, il faut d’abord digérer les protéines de l’échantillon à étudier grâce à une enzyme, afin d’obtenir des fragments protéiques (ou « peptides ») qui sont solubles dans la solution qui est injectée dans le spectromètre de masse. Ces peptides sont ensuite fragmentés par la machine. Les masses de chaque peptide et des fragments sont mesurées. Elles permettent d’identifier les peptides contenus dans l’échantillon, en comparant les données expérimentales aux données déjà existantes dans des banques.
Les données sont restituées sous une forme que l’on peut comparer à un puzzle. C’est aux scientifiques de reconstituer le puzzle pour retrouver l’identité des protéines qui étaient présentes dans l’échantillon. Ce travail est bien sûr facilité par des logiciels informatiques de plus en plus performants et des bases de données de plus en plus riches.
Collaborer pour progresser toujours plus vite
L’étude d’un protéome très complexe qui contient des milliers de protéines, comme celui du sang, du liquide séminal ou encore du liquide céphalo-rachidien, reste une aventure périlleuse qui nécessite l’expertise et la contribution de plusieurs laboratoires pendant plusieurs années. Trois sites français, localisés respectivement à Grenoble, Toulouse et Strasbourg, mettent actuellement leurs outils d’analyse et leurs données de protéomique en commun, grâce au financement des investissements d’avenir. L’objectif est de partager les expériences, de développer des logiciels et des protocoles communs pour harmoniser les données issues des différentes plateformes, puis d’élargir ce travail à d’autres sites en France et à l’étranger.

Image moléculaire du transit des spermatozoïdes dans l'épididyme de rat en imagerie par spectrométrie de masse MALDI
Grâce aux spectromètres de masse les plus récents, il devient possible d’étudier des protéines entières, sans avoir à les digérer préalablement. Cette pratique devrait connaître un essor important au cours des années à venir.
L’imagerie par spectrométrie de masse MALDI permet par ailleurs de faire du « profiling » du contenu protéique. L’appareil est par exemple capable de balayer une coupe d’échantillon et de restituer les masses mesurées sous forme de signaux de couleurs avec une très bonne résolution. Chaque protéome possède ainsi un profil sous forme de pics de couleurs.
En cancérologie, le fait de comparer le profil issu des cellules d’un patient présentant une tumeur avec celui de personnes saines peut par exemple aboutir à la mise au point d’un protocole permettant de détecter une tumeur maligne.
Ce dispositif est également de plus en plus utilisé en milieu hospitalier dans le domaine de l’infectiologie, pour caractériser des agents pathogènes en fonction de leur « profil MALDI ».
 
La protéomique pour comprendre, détecter et suivre les maladies
La protéomique permet d’étudier un échantillon biologique de façon globale, sans a priori sur les protéines susceptibles d’y être présentes. Cette approche permet d’obtenir une liste de protéines avec des données quantitatives. C’est ce qu’a fait l’équipe de Charles Pineau (Inserm U1085) pour identifier des marqueurs de la spermatogenèse. Les chercheurs ont effectué une analyse protéomique du liquide séminal et ont identifié 699 protéines parmi lesquelles au moins trois ont des niveaux d’expression associés à la fertilité ou, au contraire, l’infertilité.
De façon complémentaire, la protéomique permet également de réaliser des analyses ciblées qui visent à quantifier une protéine d’intérêt dans différents échantillons, afin d’étudier son rôle dans un système biologique. C’est par exemple ce qui est fait pour valider l’intérêt un biomarqueur dont le niveau d’expression est corrélé à un état physiologique normal ou pathologique, ou encore à la réponse à un traitement. Ce type d’approche permet aussi de suivre l’évolution d’un groupe de protéines pendant plusieurs semaines pour établir un profil d’expression en réponse à une perturbation. Cette stratégie a par exemple été utilisée pour étudier les effets du docetaxel, un traitement anti-cancéreux. Les analyses ciblées permettent enfin d’identifier des complexes de protéines. C’est ainsi que l’équipe du Pr Aleksander Edelman (Inserm U845) a pu mettre en évidence une protéine jouant un rôle clé dans la mucoviscidose : la kératine 8. Les chercheurs ont montré que, chez une majorité de patients, la kératine 8 se lie à la protéine responsable de la maladie (CFTR) et altère son fonctionnement.

La découverte de biomarqueurs, objectif majeur de la protéomique

Plaque Ciphergen pour la recherche de biomarqueurs. Plateforme de spectrométrie de masse et protéomique de l'unité 891 "Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille", CRCM, Institut Paoli-Calmettes, Marseille
Même si les domaines d’application de la protéomique sont vastes, la découverte de biomarqueurs permettant de dépister des maladies, de suivre leur évolution ou l’efficacité d’un traitement est actuellement le principal moteur de développement de cette science. De tels biomarqueurs sont déjà connus, tel le PSA dans le cancer de la prostate, mais ils sont encore rares car ils doivent être sensibles, spécifiques et leur utilisation doit être validée sur de grandes cohortes de patients.
L’utilisation d’association de biomarqueurs paraît prometteuse pour détecter des pathologies multifactorielles. En 2010, les autorités de santé américaine ont par exemple approuvé un test fondé sur la détection de cinq biomarqueurs protéiques sanguins afin d’évaluer le volume de la tumeur maligne de l’ovaire avant chirurgie (OVA1). Le projet européen DECanBio, coordonné par le Dr Jérôme Garin (CEA/Inserm/UJF U1038), va également dans ce sens. Il consiste à découvrir et valider l’utilisation de biomarqueurs urinaires permettant de détecter de façon précoce des récidives du cancer de la vessie. Pour cela, les chercheurs étudient le protéome urinaire de personnes atteintes de ce cancer, identifient des biomarqueurs potentiels et confirment leur validité dans une large cohorte de patients issue de deux pays européens et atteints de pathologies pouvant être confondues avec le cancer de la vessie. L’objectif est de s’assurer de la spécificité des biomarqueurs découverts.
Ces biomarqueurs sont utiles en cancérologie mais également dans bien d’autres domaines thérapeutiques. Ainsi, l’équipe de Virginie Brun (CEA/Inserm/UJF U1038) a validé l’intérêt du dosage sérique de cinq biomarqueurs de l'infarctus du myocarde ainsi que celui du dosage sérique extrêmement sensible d'une toxine staphylococcique (entérotoxine A) responsable de plus de 70 % des intoxications alimentaires en France.

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Paris, 16 mai 2016
Augmenter les échanges hippocampe-cortex améliore la mémoire

Pour la première fois, des chercheurs du Centre interdisciplinaire de recherche en biologie (CNRS/Inserm/Collège de France) ont établi la preuve directe que la mémorisation à long terme des souvenirs implique un échange pendant le sommeil entre deux structures du cerveau, l'hippocampe et le cortex : en augmentant cet échange, ils ont réussi à provoquer la mémorisation de souvenirs qui sinon auraient été oubliés. Ces travaux sont publiés dans la revue Nature Neuroscience le 16 mai 2016.
Depuis les années 1950, les principales théories de la mémoire postulent que les souvenirs sont initialement formés dans l'hippocampe, et progressivement transférés dans le cortex pour le stockage à long terme. Bien qu'étayée par de nombreux travaux expérimentaux, cette hypothèse n'avait jamais encore été directement validée.

Afin de prouver cette hypothèse, les chercheurs ont d'abord enregistré l'activité de l'hippocampe et du cortex pendant le sommeil. Ils ont constaté qu'il y avait une corrélation entre des ondes observées dans ces deux structures : lorsque l'hippocampe émet des ondulations, le cortex émet à son tour des ondes delta et des fuseaux de sommeil, comme en une série de questions-réponses. Pour établir un lien avec la mémoire, les chercheurs ont ensuite entraîné des rats à mémoriser les positions de deux objets identiques dans une pièce. Le lendemain, lors du test, un objet avait été déplacé et les rats devaient déterminer lequel. Les rats réussissaient le test s'ils avaient passé 20 minutes sur place le premier jour, mais ils échouaient s'ils n'étaient restés que 3 minutes. Cette différence se reflétait également dans les couplages entre hippocampe et cortex pendant le sommeil juste après la première exploration : ils étaient plus importants chez les rats qui réussissaient le test le lendemain. Restait à prouver que ces couplages étaient bien la cause de la mémorisation.

Les chercheurs ont alors mis au point un dispositif permettant de détecter en temps réel les ondulations de l'hippocampe et de déclencher aussitôt des ondes delta et des fuseaux de sommeil dans le cortex, c'est-à-dire de produire à volonté des couplages entre ces deux structures. Ils ont utilisé ce dispositif chez des rats entraînés pendant seulement 3 minutes le premier jour, et qui n'étaient donc pas censés se souvenir de l'emplacement des objets le lendemain : ces rats ont alors parfaitement réussi le test. Au contraire, si un délai variable était introduit entre les ondes hippocampiques et corticales, l'effet disparaissait.

Pour mieux comprendre les mécanismes en jeu, les chercheurs ont également enregistré l'activité du cortex pendant l'apprentissage, le sommeil et le test. Ils ont constaté que certains neurones changeaient leur activité lors du couplage au cours du sommeil, et que le lendemain le cortex répondait à la tâche en s'activant davantage près de l'objet déplacé.

Ces travaux, en démontrant les mécanismes de la mémorisation à long terme, pourraient permettre de mieux comprendre certains troubles de mémorisation chez l'homme. On pourrait ainsi envisager de pallier certains déficits de mémoire, s'ils relèvent du même mécanisme que celui étudié. Cependant, avant toute mise en application clinique, il faudra impérativement résoudre les questions éthiques liées à ces techniques et les affiner pour pouvoir agir sélectivement sur les souvenirs que l'on souhaite renforcer. Le but de l'équipe est maintenant de mieux comprendre les échanges d'informations entre l'hippocampe et le cortex, notamment lorsque plusieurs souvenirs doivent être mémorisés ou non.

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La recherche d’anti-inflammatoires inspirée par le dialogue moléculaire entre un parasite et son hôte

Toxoplasma, l’agent de la toxoplasmose, crée des conditions d’inflammation appropriées pour lui permettre d’effectuer son cycle infectieux sans mettre en péril la survie de son hôte. Des chercheurs de l’Institute for Advanced Biosciences et de l’EMBL-Grenoble, ont découvert comment Toxoplasma détourne une des plus anciennes voies de transduction du signal impliquée dans l’immunité des animaux. Ces travaux qui ouvrent la voie au développement d’un outil de criblage de nouvelles molécules anti-inflammatoires, ont été publiés le 14 novembre 2016 dans la revue Structure.

Toxoplasma est l’agent pathogène responsable de la toxoplasmose, une infection quasiment asymptomatique chez les personnes immunocompétentes mais qui peut se manifester sévèrement chez les individus dont le système immunitaire est affaibli (infection VIH, cancérothérapies, greffes) ou immature (toxoplasmose congénitale).
Toxoplasma se développe dans une vacuole « parasitophore » qui l’isole du milieu intracellulaire de la cellule qui l’héberge. Tout en le protégeant des défenses cellulaires de son hôte, cette vacuole lui permet de créer un environnement singulier et propice à sa multiplication. Pendant toute la durée du cycle infectieux, il injecte également des effecteurs protéiques dans sa cellule hôte pour détourner des fonctions cellulaires essentielles à son propre avantage.
Quand une cellule dans votre corps détecte un parasite, elle déclenche une réaction en chaîne. À l'intérieur de cette cellule, une série de molécules s'activent mutuellement jusqu'à ce qu'une protéine appelée p38α soit activée et se déplace dans le noyau de la cellule où elle y active les gènes qui déclenchent la réponse inflammatoire. Le but ultime de cette réponse est d'éliminer l'agent pathogène. On pourrait s'attendre à ce que des parasites comme Toxoplasma veuillent surmonter cette réponse, mais Mohamed-Ali Hakimi et ses collègues de l’Institute for Advanced Biosciences ont découvert il y a quelques années que Toxoplasma sécrète une protéine, GRA24, qui fait tout le contraire: elle active de manière permanente notre réponse inflammatoire.
«Ce parasite remodèle la réponse inflammatoire de l'hôte», explique Matthew Bowler de l'EMBL. "Il subvertit ainsi les voies de signalisation qui normalement participent aux défenses de notre corps."
Les chercheurs ont découvert que GRA24 a la propriété de court-circuiter cette cascade en provoquant l’autophosphorylation prolongée de p38α, puis son accumulation dans le noyau de la cellule infectée. En utilisant une combinaison de techniques structurales, ils ont découvert que GRA24 s'attache beaucoup plus fortement à p38α et entre en compétition avec les protéines de la cellule infectée. En produisant une protéine qui se lie directement, et très étroitement, à p38α, Toxoplasma vient contrôler le niveau de la réponse inflammatoire en rendant inaccessible p38α aux protéines qui normalement viennent l’inactiver. C'est pourquoi le toxoplasme n’est pas considéré comme une grave menace pour la santé, sauf pour les femmes enceintes et les personnes ayant un système immunitaire compromis.
Le mécanisme d’action de GRA24 sur p38α a permis de découvrir  une nouvelle façon d'évaluer l'efficacité des anti-inflammatoires, dont beaucoup sont conçus pour bloquer p38α. Jusqu'à présent, il a été difficile d'évaluer leur efficacité, parce que les scientifiques n'ont pas eu un bon moyen de produire une forme active de p38α en laboratoire. En co-produisant GRA24 associé à p38α, Matthew Bowler et Mohamed-Ali Hakimi avec leurs collègues et l'aide de la plateforme EMBL d'expression et de purification des protéines, ont ouvert la voie à la mise au point d'un nouvel outil de criblage de candidats-médicaments anti-inflammatoires ciblant spécifiquement p38α dans son état actif.



En savoir plus
* Structural Basis for the Subversion of MAP Kinase Signaling by an Intrinsically Disordered Parasite Secreted Agonist. 
Pellegrini E, Palencia A, Braun L, Kapp U, Bougdour A, Belrhali H, Bowler MW, Hakimi MA.
Structure. 2016 Nov 14. pii: S0969-2126(16)30338-0. doi: 10.1016/j.str.2016.10.011.
 



 Contact chercheur
* Mohamed-ali Hakimi
Equipe interactions Hôte-Pathogène et immunité des infections
IAB - Institute for Advanced Biosciences
CNRS UMR5309 – INSERM U1209 - Université Grenoble Alpes
Site Santé  
Allée des Alpes 
38700 La Tronche  
Mise en ligne le 8 décembre 2016

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Paris, 18 avril 2013

Les bébés doués de conscience ?

Les bébés ont longtemps été considérés comme des êtres aux compétences limitées et ayant des comportements principalement automatiques, de type réflexe, qui ne s'accompagnent pas d'une expérience subjective consciente. Et pourtant : des chercheurs du CNRS au Laboratoire de sciences cognitives et psycholinguistiques (CNRS/ Ecole normale supérieure, Paris/EHESS) en collaboration avec des chercheurs de NeuroSpin (Inserm/CEA) montrent que les nourrissons possèdent dès 5 mois une forme de conscience similaire à celle des adultes. Ces résultats sont publiés dans Science le 19 avril 2013.

Comment déterminer si les bébés sont conscients de leur environnement alors même qu'ils ne savent pas encore parler et sont incapables de communiquer leurs propres pensées ? Pour résoudre cette question complexe, les chercheurs ont utilisé une approche alternative consistant à déterminer si les marqueurs neuronaux de la conscience observés chez des adultes pouvaient être également présents chez le bébé. En effet, chez l'adulte, des recherches récentes montrent que le cerveau répond en deux étapes à la perception d'un évènement extérieur. Pendant les premières 200 à 300 millisecondes, le traitement perceptif est totalement non-conscient et s'accompagne d'une activité neuronale qui augmente de façon linéaire, c'est-à-dire avec une amplitude qui croit de manière constante en fonction de la durée de présentation des objets perçus. Puis, une seconde étape, plus tardive (après 300 ms), se caractérise par une réponse non-linéaire correspondant au seuil de la conscience. Seules les durées de présentation assez longues pour atteindre ce seuil donnent lieu à une réponse tardive et s'accompagnent d'une perception consciente. Cette réponse tardive et non-linéaire du cerveau est considérée comme un marqueur neuronal de la conscience.

Dans cette étude, la présence de ce marqueur de conscience a été testée sur 80 nourrissons âgés de 5, 12 et 15 mois. Pour ce faire, ils ont été invités à regarder des visages présentés plus ou moins longuement (donc sur des durées inférieures ou supérieures à leur seuil de perception), tandis que les réponses électriques de leur cerveau étaient enregistrées par électro-encéphalographie. Pour tous les groupes d'âge, les chercheurs ont observé la même réponse tardive et non-linéaire que chez les adultes, confirmant la présence de cette « signature neuronale de la conscience » chez les bébés. Toutefois, alors que cette réponse est enregistrée autour de 300 ms chez l'adulte, celle-ci est beaucoup plus tardive chez les bébés, ne s'établissant qu'après au moins une seconde chez les enfants les plus jeunes. Ces résultats révèlent que les mécanismes cérébraux qui sous-tendent la conscience perceptive sont déjà présents très tôt chez les nourrissons. Mais ceux-ci sont relativement lents et subissent une accélération progressive au cours du développement.



Références :
Kouider, S., Stahlhut, C., Gelskov, S., Barbosa, L, de Gardelle, V., Dutat, M., Dehaene, S., & Dehaene-Lambertz, G. “A neural marker of perceptual consciousness in infants” («Un marqueur neuronal de la conscience perceptive chez les bébés »)
Science, 19 avril 2013.
Contacts :
Chercheur CNRS l Sid Kouider l T 00 45 50 21 11 75 (jusqu'au 21 avril 2013) et T 06 64 12 66 59 (à partir du 22 avril 2013) l sid.kouider@ens.fr

Presse CNRS l Laetitia Louis l T 01 44 96 51 37 l laetitia.louis@cnrs-dir.fr

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