Les Nanoblades : des navettes pour opérer le génome

COMMUNIQUÉ | 27 MARS 2019 - 16H12 | PAR INSERM (SALLE DE PRESSE)

BIOLOGIE CELLULAIRE, DÉVELOPPEMENT ET ÉVOLUTION | IMMUNOLOGIE, INFLAMMATION, INFECTIOLOGIE ET MICROBIOLOGIE



Pour éditer le génome de façon précise, les chercheurs disposent désormais des « ciseaux génétiques » CRISPR/Cas9, outil très prometteur pour la thérapie génique. Le défi technologique aujourd’hui est d’amener cet outil jusqu’au génome de certaines cellules. Dans cet objectif, une équipe associant l’Inserm, le CNRS, l’Université Claude Bernard Lyon 1 et l’École normale supérieure de Lyon au sein du Centre international de recherche en infectiologie (CIRI) ont développé des capsules permettant d’amener CRISPR/Cas9 jusqu’à l’ADN cible : les Nanoblades. Décrites dans Nature Communications, elles ouvrent des perspectives pour la recherche sur l’édition du génome des cellules souches humaines.

Depuis 2012, la communauté scientifique dispose d’une méthode révolutionnaire pour « opérer » le génome de façon précise : le système CRISPR/Cas9. Ces ciseaux moléculaires sont capables de couper l’ADN à un endroit précis dans une grande variété de cellules. Ils offrent par conséquent des perspectives considérables pour la recherche et pour la santé humaine. Cependant, amener ces « ciseaux génétiques » jusqu’à leur cible – notamment le génome de certaines cellules souches – reste un défi technique.

C’est sur cette problématique que travaillent des équipes de recherche de l’Inserm, du CNRS, de l’Université Claude Bernard Lyon 1 et de l’École normale supérieure de Lyon qui ont développé les Nanoblades[1], des particules qui permettent de délivrer CRISPR/Cas9 dans de nombreuses cellules, y compris des cellules humaines.
Les scientifiques ont eu l’idée d’encapsuler le système CRISPR/Cas9 dans des structures ressemblant beaucoup à des virus et assurer ainsi sa livraison au sein d’une cellule cible, en fusionnant avec la membrane de cette dernière.  

Pour concevoir ces Nanoblades, les chercheurs ont exploité les propriétés de la protéine rétrovirale GAG, qui a la capacité de produire des particules virales non infectieuses car dénuées de génome. L’équipe de recherche a fusionné la protéine GAG d’un rétrovirus de souris avec la protéine CAS9 – le ciseau du système CRISPR. Cette nouvelle protéine dite « fusion » fait l’originalité des Nanoblades.

Par conséquent, et à l’inverse des techniques classiquement utilisées pour modifier le génome, les Nanoblades encapsulent un complexe CRISPR/Cas9 immédiatement fonctionnel ; elles ne délivrent donc aucun acide nucléique codant le système CRISPR/Cas9 dans les cellules traitées. « L’action de CRISPR/Cas9 dans les cellules est ainsi temporaire. Elle est également plus précise et préserve les régions non ciblées du génome, atout particulièrement important dans le cadre d’applications thérapeutiques », précisent les auteurs.
Enfin, les chercheurs ont utilisé une combinaison originale de deux protéines d’enveloppe virales à la surface des Nanoblades pour leur permettre d’entrer dans une large gamme de cellules cibles.

 Les scientifiques ont démontré l’efficacité des Nanoblades in vivo, dans l’embryon de souris, pour un large spectre d’applications et dans un large panel de cellules cibles où d’autres méthodes sont peu performantes. « Les Nanoblades s’avèrent notamment efficaces pour corriger le génome des cellules souches humaines, cellules d’un grand intérêt thérapeutique (notamment dans la reconstitution de tissus) mais restant difficiles à manipuler par les méthodes habituelles », précisent les auteurs de ces travaux.

[1] Les Nanoblades ont été testées chez la souris et brevetées en 2016 par Inserm Transfert.

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Une nouvelle méthode plus efficace pour diagnostiquer Alzheimer

COMMUNIQUÉ | 18 SEPT. 2019 - 16H39 | PAR INSERM (SALLE DE PRESSE)

NEUROSCIENCES, SCIENCES COGNITIVES, NEUROLOGIE, PSYCHIATRIE


Inserm/Auzias, Guillaume/Baillet, Sylvie/Colliot, Olivier

Actuellement, l’analyse anatomique du cortex cérébral par IRM, permet d’appuyer le diagnostic de la maladie d’Alzheimer dans 80 % des cas. Et si l’analyse d’une autre structure cérébrale, pouvait donner de meilleurs résultats ? C’est ce que montre l’équipe de chercheurs associant l’Inserm, l’Université de Paris et le CEA sous la direction de Maxime Bertoux désormais chercheur Inserm au sein de l’unité 1171 Troubles cognitifs dégénératifs et vasculaires (Inserm / Université de Lille / CHU de Lille). Selon son étude publiée dans Neurobiology of Aging, l’analyse de la morphologie des sillons corticaux permettrait de reconnaître la maladie d’Alzheimer dans 91 % des cas. En outre, la taille de ces sillons apparaît associée au stade d’évolution de la maladie et du déclin cognitif. Ces travaux suggèrent l’intérêt de cette méthode dans le diagnostic et le suivi des patients.

L’analyse anatomique du cerveau par IRM (imagerie par résonance magnétique) consiste habituellement à mesurer l’épaisseur du cortex cérébral (le tissu aussi appelé « substance grise », qui recouvre les deux hémisphères du cerveau) ou le volume de plusieurs régions du cerveau comme l’hippocampe, dont l’atrophie est un des premiers signes de la maladie d’Alzheimer. Cette méthode permet de détecter la maladie correctement dans environ 80% des cas. L’équipe de Maxime Bertoux, chercheur Inserm montre que l’analyse des sillons corticaux par IRM fait mieux.

Les sillons sont des circonvolutions du cerveau qui ont tendance, au cours du vieillissement, à s’élargir. Cette évolution des sillons s’accompagne d’une diminution de l’épaisseur du cortex qui les borde. L’accélération de ce phénomène dans la maladie d’Alzheimer avait été mis en évidence par la même équipe dans de précédents travaux. L’équipe a cette fois cherché à vérifier si l’analyse morphologique des sillons pouvait constituer un marqueur diagnostic de la maladie et de son stade d’évolution.

Les chercheurs ont effectué une IRM cérébrale chez 51 patients atteints de la maladie d’Alzheimer dont certains à un stade précoce et d’autres à un stade avancé, ainsi que chez 29 participants contrôles non atteints par la maladie. Le diagnostic était effectué à l’issue d’un bilan biologique, reposant à la fois sur une ponction lombaire pour rechercher la présence des biomarqueurs de la maladie et sur une imagerie par émission de positron (PET-scan), montrant les dépôts amyloïdes, des accumulations d’agrégats protéiques sous forme de plaques caractéristiques de certaines maladies neurodégénératives.
Les chercheurs ont ensuite utilisé le logiciel Morphologist récemment développé à NeuroSpin (Centre de neuroimagerie du CEA), qui permet de recréer informatiquement à partir d’une IRM un « moule » en négatif du cerveau. Le logiciel a ensuite extrait dans 18 régions de chaque hémisphère cérébral, une valeur moyenne de la largeur de chaque sillon et de l’épaisseur du cortex les bordant. En parallèle, les chercheurs ont effectué les mesures usuelles du volume de plusieurs régions cérébrales et de l’épaisseur du cortex, afin de comparer ces techniques.

Un algorithme a ensuite permis de corréler l’état de santé de chaque participant (contrôle ou malade) aux mesures obtenues. Les chercheurs ont alors constaté que la largeur d’un groupe de quelques sillons, appartenant notamment aux lobes frontaux et temporaux, était associée à la maladie d’Alzheimer. Il permettait de déterminer l’état de santé des participants dans 91% des cas, contre seulement 80% pour les mesures anatomiques usuelles. En outre, la morphologie des sillons semble évoluer avec les stades de la maladie : ils étaient plus larges chez les patients présentant les déclins cognitifs les plus poussés.  

« Ces mesures reflétant l’évolution de la maladie apparaissent corrélées à la performance cognitive, explique Maxime Bertoux, ce qui peut être très utile lors d’essais cliniques évaluant l’efficacité d’un potentiel médicament. De plus, ces mesures ne nécessitent qu’une IRM et une analyse largement automatisée qui peuvent être réalisées dans de nombreux centres de soin. Cette technique doit encore être validée sur de plus grands échantillons de patients, mais elle pourrait avoir un grand intérêt sur le plan clinique », conclut-il. Le chercheur exploite déjà cette nouvelle approche pour détecter des signatures spécifiques d’autres maladies neurodégénératives, en particulier la démence fronto-temporale.

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Un vaccin contre les maladies inflammatoires chroniques

| 11 DÉC. 2019 - 11H00 | PAR INSERM (SALLE DE PRESSE)

IMMUNOLOGIE, INFLAMMATION, INFECTIOLOGIE ET MICROBIOLOGIE | PHYSIOPATHOLOGIE, MÉTABOLISME, NUTRITION


Observation de colon par microscopie confocale. Les bactéries du microbiote sont visualisées en rouge, le mucus intestinal en vert, les cellules intestinales en violet et leur ADN en bleu. Crédits : Benoît Chassaing
Chez l’animal, un vaccin modifiant la composition et la fonction du microbiote intestinal permet de protéger contre l’apparition des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin et contre certaines dérégulations métaboliques, telles que le diabète ou l’obésité. Ces travaux sont menés par l’équipe de Benoît Chassaing, chercheur Inserm au sein de l’Institut Cochin (Inserm/CNRS/Université de Paris), et les premiers résultats sont parus dans Nature Communications.
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont associées à des anomalies du microbiote intestinal chez l’animal et chez l’homme. Les sujets concernés présentent le plus souvent une moindre diversité bactérienne au sein de leur flore intestinale, mais également un excès de bactéries exprimant une protéine appelée flagelline, qui favorise leur mobilité. Cela leur permet notamment de pénétrer dans la couche de mucus qui recouvre la paroi intestinale et qui est normalement stérile. En effet, cette couche est censée former un mur hermétique aux bactéries entre l’intérieur du tube digestif et le reste de l’organisme, le protégeant ainsi du risque d’inflammation lié à la présence des milliards de bactéries de la flore intestinale.

De précédents travaux avaient déjà montré qu’au sein de cette couche de mucus, on trouve naturellement des anticorps, dont certains dirigés contre la flagelline. Cela signifie que l’organisme développe spontanément une protection immunitaire contre la flagelline, qui permet de contrôler la présence des bactéries qui l’expriment. Avec ses collègues, Benoit Chassaing, chercheur Inserm a eu l’idée de stimuler cette production d’anticorps anti-flagelline afin de réduire la présence de bactéries exprimant la flagelline dans le microbiote intestinal, dans le but de diminuer le risque d’inflammation chronique.

Comme ils le décrivent dans leur étude publiée dans Nature Communications, les chercheurs ont administré de la flagelline par voie péritonéale à des souris, induisant ainsi une forte augmentation des anticorps anti-flagelline, notamment au niveau de la muqueuse intestinale. Les chercheurs ont ensuite appliqué un protocole visant à induire une inflammation intestinale chronique chez ces animaux. Ils ont constaté qu’une immunisation contre la flagelline permettait de protéger significativement les animaux contre l’inflammation intestinale. En outre, une analyse fine du microbiote et de leurs intestins a montré, d’une part, une réduction de la quantité de bactéries exprimant fortement la flagelline et d’autre part, l’absence de ces bactéries dans la muqueuse intestinale, par opposition au groupe non vacciné.

L’excès de flagelline dans le microbiote intestinal ayant également été associé à des désordres métaboliques, notamment au diabète et l’obésité, les chercheurs ont testé leur stratégie vaccinale chez des souris exposées à un régime riche en graisse. Alors que les animaux non vaccinés ont développé une obésité, les animaux vaccinés ont été protégés.
« Cette stratégie vaccinale est envisageable chez l’homme, puisque de telles anomalies de microbiote ont été observées chez les patients atteints de maladies inflammatoires et métaboliques. Pour cela, nous travaillons actuellement sur un moyen d’administrer localement la flagelline au niveau de la muqueuse intestinale », explique Benoît Chassaing. Les chercheurs réfléchissent par exemple à la possibilité de développer des nanoparticules ingérables et remplies de flagelline. Enfin, au-delà de l’aspect préventif, ils souhaitent maintenant tester cette vaccination en mode curatif, chez des animaux présentant déjà une maladie inflammatoire chronique ou des dérégulations métaboliques.

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Exposition prénatale aux perturbateurs endocriniens et troubles du comportement des enfants

COMMUNIQUÉ | 29 SEPT. 2017 - 10H22 | PAR INSERM (SALLE DE PRESSE)

SANTÉ PUBLIQUE

Une étude épidémiologique menée par l’Inserm[1] sur les familles de la cohorte EDEN (500 garçons nés entre 2003 et 2006 et leurs mères) montre que l’exposition pendant la grossesse à certains phénols et phtalates est associée à des troubles du comportement des garçons entre 3 et 5 ans. Les composés les plus préoccupants à cet égard sont le bisphénol A, le triclosan et le di-n-butyl phtalate, ou DBP. Les résultats viennent d’être publiés dans la revue Environmental Health Perspectives.

Le bisphénol A a été interdit de tous les contenants alimentaires en France en janvier 2015, une date ultérieure à la réalisation de cette étude. Le triclosan est un agent antibactérien retrouvé dans certains dentifrices et savons ; le DBP est utilisé comme plastifiant dans les plastiques de type PVC, certaines colles, vernis à ongles et laques pour les cheveux. Triclosan et DBP sont réglementés selon la logique d’une valeur limite dans certaines familles de produits, tout en étant interdits dans d’autres (le DBP est par exemple interdit d’usage dans les cosmétiques et le triclosan dans les habits dans l’UE). Des études toxicologiques in vitro et chez l’animal ont mis en évidence que ces composés étaient des perturbateurs endocriniens et pouvaient interagir avec des systèmes hormonaux impliqués dans le développement normal du système nerveux central. Les mécanismes précis qui pourraient expliquer un effet des perturbateurs endocriniens sur le neurodéveloppement et le comportement pourraient passer par une altération du fonctionnement des hormones thyroïdiennes, des hormones stéroïdiennes, comme l’œstrogène, ou d’autres hormones, comme l’ocytocine ou la vasopressine, des hormones sécrétées par l’hypothalamus.

Face à ces premières conclusions chez l’animal, les chercheurs ont souhaité étudier l’association entre les expositions aux perturbateurs endocriniens pendant la grossesse et le comportement ultérieur des enfants.
L’étude a porté sur 529 petits garçons de la cohorte mère-enfant EDEN, mise en place par l’Inserm. Les femmes enceintes participant à cette cohorte ont été recrutées entre 2003 et 2006 dans les CHU de Nancy et Poitiers. Aux troisième et cinquième anniversaires de l’enfant, ces mamans ont rempli un questionnaire standardisé évaluant certains aspects du comportement de leur enfant tel que l’hyperactivité, les troubles émotionnels et les troubles relationnels. Ce questionnaire standardisé, utilisé depuis une vingtaine d’années, intitulé « Questionnaire des forces et difficultés » de l’enfant, permet d’établir un score dans différentes dimensions du comportement tels que les symptômes émotionnels, les problèmes de relation avec les pairs, les problèmes de conduite, d’hyperactivité et d’inattention. Un échantillon d’urine prélevé durant la grossesse a permis le dosage de biomarqueurs caractéristique de l’exposition aux phénols et aux phtalates dans le Laboratoire de Santé Environnementale des CDC d’Atlanta, qui est en charge des campagnes de biosurveillance américaines.
De 70 à 100% des femmes de la cohorte Eden, recrutées durant leur grossesse entre 2003 et 2006, étaient alors exposées à des niveaux détectables de différentes substances. Les niveaux urinaires étaient de l’ordre de 1 à 3 µg par litre pour le bisphénol A, de 10 à 100 µg par litre pour le triclosan, et de 50 à 200 pour le méthylparabène. Les résultats suggèrent que l’exposition maternelle à certains phénols et phtalates est associée à des troubles du comportement des petits garçons.

L’exposition au bisphénol A était associé à une augmentation des troubles relationnels à 3 ans et des comportements de type hyperactif à 5 ans. Les chercheurs notent que ce travail confirme ainsi que les effets du bisphénol A sur le comportement observés chez l’animal de laboratoire se retrouvent chez l’humain à des expositions faibles, probablement inférieures à celles préconisées par l’autorité européenne de sécurité alimentaire, l’EFSA.

Le métabolite du DBP était lui associé à davantage de troubles émotionnels et relationnels, incluant les comportements de repli, à 3 ans, mais pas à 5 pour les troubles émotionnels. Des associations entre ces composés et le comportement avaient déjà été mis en évidence dans des études précédentes chez de jeunes garçons et chez l’animal. Ainsi, dans une étude réalisée à partir de femmes et d’enfants new-yorkais, une augmentation des comportements de repli chez les enfants de 3 ans avec des niveaux croissants du métabolite du DBP avaient été rapportés en 2012.

Les résultats de cette étude ont aussi montré une association entre le triclosan et une augmentation des troubles émotionnels à 3 et 5 ans. Il s’agit de la première étude évaluant les effets de ce composé sur le comportement, pour lequel l’équipe d’épidémiologie environnementale de Grenoble avait déjà mis en évidence une diminution du périmètre crânien à la naissance, dans cette même population. Au niveau moléculaire, le triclosan est capable d’interagir avec l’axe thyroïdien qui, pendant la grossesse, est impliqué dans le développement du cerveau du fœtus.
L’effectif de l’étude, qui est une des plus vaste sur la question, ne permettait pas d’étudier directement la survenue de pathologies du comportement comme les troubles du spectre autistique, ce qui impliquerait de suivre des dizaines de milliers d’enfants.

Les équipes de recherche vont désormais s’attacher à répliquer ces résultats au sein de la cohorte mère-enfant SEPAGES en cours dans la région Grenobloise, coordonnée par l’Inserm et soutenue par l’European Research Council. Dans cette dernière, de nombreux échantillons d’urine par participant sont recueillis durant la grossesse et les premières années de vie de l’enfant. Cette approche permettra de limiter les erreurs de mesure de l’exposition et d’identifier de potentielles périodes de sensibilité aux phénols et phtalates sur différents événements de santé tels que la croissance, le comportement ou la santé respiratoire. Cela permettra aussi d’étudier l’effet éventuel de ces substances chez les petites filles, qui n’avaient pu être considérées ici. Il est possible que leur sensibilité aux perturbateurs endocriniens diffère de celle des garçons.

[1] Un consortium de recherche associant des équipes de recherche Inserm, les CHU de Nancy et Poitiers, le Center for Disease Controls and Prevention (CDC, Atlanta, USA), et coordonné par l’équipe d’épidémiologie environnementale de l’Institut pour l’Avancée des Biosciences (Inserm/CNRS/Université Grenoble Alpes).

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